Jedynym badaniem rekomendowanym przez Światową Organizację Zdrowia do diagnozowania pacjentów z koronawirusem jest badanie genetyczne metodą real-time PCR. Czym ono różni się od standardowego PCR i w jakich dziedzinach medycyny znajduje jeszcze zastosowanie? Tego wszystkiego dowiesz się z artykułu.

Metoda real-time PCR jest znana od początku lat 90. XX w. Jednak ostatnio, przy okazji pandemii SARS-Cov-2, zrobiło się o niej szczególnie głośno. Jedynym badaniem rekomendowanym przez Światową Organizację Zdrowia do diagnozowania pacjentów z koronawirusem jest bowiem właśnie badanie genetyczne metodą real-time PCR (skrót qPCR). Czym ono różni się od standardowego PCR i w jakich dziedzinach medycyny znajduje jeszcze zastosowanie? Tego wszystkiego dowiesz się z artykułu.

real-time PCR – kilka słów historii…

Opracowanie w 1983 roku przez Kary’ego Mullisa łańcuchowej reakcji polimerazy PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) stało się kamieniem milowym w dziedzinie diagnostyki. Dzięki tej metodzie jesteśmy w stanie w ciągu zaledwie kilku godzin zidentyfikować i zwielokrotnić dowolny fragment kwasu nukleinowego. Prawdziwa rewolucja przyszła jednak na początku lat 90. poprzedniego stulecia, kiedy to Russ Higuchi opracował metodę PCR w czasie rzeczywistym (ang. real-time PCR). Miała ona ulepszyć analizę diagnostyczną zarówno pod względem jakościowym jak i ilościowym. Obecnie real-time PCR jest jedną z najczęściej wykorzystywanych metod analizy genetycznej – w medycynie, diagnostyce czy kryminalistyce.

Na czym polega real-time PCR?

Metoda real-time PCR umożliwia pomiar ilości nowych kopii produktu reakcji w dowolnym punkcie czasowym (w czasie rzeczywistym). Jest to technika bardzo czuła, umożliwiające wykrycie nawet jednej kopii badanego genu. Od tradycyjnego PCR różni się tym, że analizuje przyrost produktów reakcji PCR po każdym cyklu reakcji, a nie wyłącznie po ostatnim. Dzięki swojej specyfice metoda qPCR stała się cennym narzędziem diagnostycznym. Przede wszystkim pozwalającym przewidywać zakażenie, którego objawy nie są jeszcze manifestowane, rozpoznawać, na jakim to zakażenie jest etapie, a także monitorować skuteczność zastosowanego leczenia przeciwwirusowego.

Dowiedz się więcej: Testy na koronawirusa – dostępne rodzaje zasady działania 

Metoda real-time PCR krok po kroku

Analiza przyrostu produktu (amplifikacji) w czasie rzeczywistym możliwa jest dzięki zastosowaniu odpowiednich barwników lub sond fluorescencyjnych. Urządzenie, w którym przeprowadzana jest reakcja mierzy zmiany poziomu we fluorescencji badanej próbki w trakcie każdego cyklu amplifikacji. Jak to wygląda krok po kroku?

Najpierw z badanej próbki izolowane jest całkowite RNA, w którym znajdują się również fragmenty wirusowego RNA. Następnie składany jest specyficzny dla danego zestawu mix reakcyjny, w którym znajduje się enzym (odwrotna transkryptaza), umożlwiający przepisanie wirusowego RNA na DNA. W kolejnych cyklach reakcji real-time PCR sekwencje wirusowych i ludzkich genów są amplifikowane dzięki zastosowaniu specyficznych dla nich starterów. Przyrost produktów w czasie jest monitorowany, odnoszony do poziomu notowanej przez aparat fluorescencji i wprost proporcjonalny do ilości powstających kopii amplifikowanych fragmentów.

Badanie metodą real-time PCR – potwierdzi zakażenie koronawirusem!

Najskuteczniejszym sposobem zatrzymania szerzącej się pandemii COVID-19 jest jak najszybsze wykrywanie wirusa SARS-CoV-2 i izolacja osób zakażonych. Zgodnie z wytycznymi Światowej Organizacji Zdrowia, aby móc zdiagnozować u kogoś infekcję, konieczne jest stwierdzenie obecności materiału genetycznego wirusa w pobranej od pacjenta próbce. Jedynym narzędziem, które to umożliwia jest właśnie badanie genetyczne metodą qPCR. Taki test może wykryć obecność materiału genetycznego wirusa jeszcze przed wystąpieniem pierwszych objawów choroby. Badanie charakteryzuje się największą czułością między 7. a 14. dniem od potencjalnego kontaktu z patogenem/ osobą zakażoną. Próbkę do badania stanowi wymaz z górnych lub dolnych dróg oddechowych – wymaz z nosogardzieli, gardła i nosa, a także aspiraty przeztchawicze i popłuczyny oskrzelowo-pęcherzykowe.

Ogromną zaletą diagnostyki opartej na tej metodzie, jest fakt, że aby stwierdzić infekcję, chory nie musi mieć objawów. Badanie wykryje obecność wirusa również u pacjenta skąpo – lub bezobjawowego.

real-time PCR – metoda diagnostyczna o szerokim zastosowaniu

Choć wielu z nas o istnieniu technologii real time PCR dowiedziało się w ostatnim czasie, przy okazji trwającej pandemii, warto wiedzieć, że od wielu lat jest ona powszechnie wykorzystywana również w diagnostyce innych chorób wirusowych i bakteryjnych. Doskonale sprawdza się w diagnostyce: wirusowego zapalenia wątroby (WZW), boreliozy (choroby przenoszonej przez kleszcze), wirusa HIV, wirusa brodawczaka ludzkiego (HPV), cytomegalii (CMV) czy chorób układu moczowo-płciowego, wywoływanych przez bakterie, takie jak: Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, Ureoplasma palvum).

Zobacz też: Chlamydia – choroba przenoszona drogą płciową

real-time PCR w diagnostyce HPV

Wirus brodawczaka ludzkiego HPV (ang. Human Papilloma Virus) jest patogenem bardzo powszechnym w naszej populacji. Teoretycznie aż 80% z nas, przynajmniej raz w życiu, ma z nim styczność. Do tej pory opisano ponad 200 różnych typów wirusa HPV. Nie wszystkie są niebezpieczne. Niektóre typy powodują jedynie niegroźne kurzajki na skórze dłoni czy stóp. Inne atakują narządy płciowe, wywołując tzw. kłykciny kończyste. Niestety istnieją także bardziej niebezpieczne odmiany HPV, tzw. wysokoonkogenne, których obecność predysponuje do rozwoju raka. Najskuteczniejszą metodą diagnostyczną w przypadku wirusa HPV jest test genetyczny wykonany właśnie metodą real-time PCR. Identyfikuje ona materiał genetyczny wirusa, określa jego typ, a co za tym idzie pozwala ocenić ryzyko, z jakim u badanego może rozwinąć się nowotwór.

real-time PCR w diagnostyce infekcji układu moczowo-płciowego

Kiedyś uważane za błahą przypadłość, dziś infekcje intymne stanowią poważny problem zdrowotny. Nieleczone mogą być przyczyną przykrych dolegliwości – swędzenia, pieczenia, upławów o nieprzyjemnym zapachu, a także utrudnić kobiecie poczęcie dziecka i utrzymanie ciąży. Infekcja układu moczowo-płciowego może mieć pochodzenie wirusowe, bakteryjne lub grzybicze. Do najczęstszych zaliczamy bakterie: Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium czy Ureaplasma urealyticum. Obecność patogenów odpowiedzialnych rozwój infekcji intymnych można potwierdzić badaniem genetycznym wykonanym metodą real-time PCR.

Czytaj więcej: Gdy swędzi i piecze – infekcje intymne i ich wpływ na płodność kobiet

Reasumując, real-time PCR jest metodą diagnostyczną, powszechnie stosowaną w medycynie do diagnozowania chorób wirusowych i bakteryjnych. Głośno zrobiło się o niej przy okazji obecnej pandemii, ponieważ jest to jedyne badanie diagnostyczne w kierunku SARS-CoV-2 rekomendowane przez Światową Organizację Zdrowia. Z powodzeniem wykrywa wirusa już na wczesnym etapie rozwoju infekcji.